Проблема очистки вирусных препаратов
Если при титровании в препаратах и допускаются обломки клеток, то проводить другие исследования они мешают. К примеру, клеточные компоненты, по форме и размерам сходные с исследуемыми вирусами, трудно будет отличить при электронномикроскопических исследованиях.
Решить задачу очистки вирусных препаратов намного труднее, чем найти иголку в стоге сена. Иголку хоть можно увидеть да и физические свойства ее значительно отличаются от сушеной травы (благодаря чему, например, стальную иголку можно вытащить из стога магнитом). Вирус — невидимка, а многие физические свойства его точно такие же, как и других биологических частичек, вместе с которыми он плавает в растворе.
Для решения такой задачи нужны хорошие знания физики и химии, обстоятельное знакомство с современными методами исследований и смекалка.
Наиболее распространенный метод выделения вирусов основан на разности масс и размеров различных компонентов растворов, где находятся вирусы, и называется он методом дифференциального центрифугирования. Вирусы, устойчивые к действию спирта, можно сконцентрировать с помощью спиртов.
Известно, что вирус гриппа обладает способностью агглютинировать (склеивать) эритроциты. И эта его способность используется для предварительной очистки. В основе метода гельфильтрации заложено различие в размерах компонентов, а в основе хромотографии — различие в химических свойствах.
Впервые очищенный препарат вируса был получен в 1935 г. У. М. Стэнли очистил и выделил в кристаллическом виде вирус мозаики табака. Первый метод был заимствован из химии белков и основан на том, что растворимость различных белковых тел при изменении степени кислотности растворов происходит по-разному. Начинают выделение с того, что листья растений табака замораживают в течение нескольких часов, после чего их измельчают. Измельченный материал разводят буферраствором фосфорной кислоты и ее солей. После тщательного взбалтывания смесь фильтруют сначала через марлю, а затем через инфузорную землю. В фильтрат добавляют раствор сернокислого аммония, под действием которого и происходит осаждение вируса. При следующей фильтрации вирус адсорбируется на особом поглотителе — инфузорной земле, которую снова промывают фосфатным буфером. Вирус переходит в раствор. Переосаж^ение и перерастворение вируса производят несколько раз, повышая тем самым его концентрацию. Последней операцией является добавление в фильтрат насыщенного раствора сернокислого аммония и ледяной уксусной кислоты. Вирусы выпадают в виде микроскопических игловидных паракристаллов (жидких кристаллов). К сожалению, чуть ли не к каждому возбудителю болезней требуется особый подход, и бывает, что поиск индивидуальных путей очистки длится долгие годы. Так, например, вирус полиомиелита самому У. М. Стэнли удалось выделить только в 1955 г.
Несколько других методов очистки основаны на свойстве коллоидных систем разрушаться в определенных условиях, например когда в растворе, стабилизированном электролитом, число отрицательных частиц равно числу положительных (в так называемых изоэлектрических точках).
Некоторые вирусы, патогенные для животных и человека, выделяются путем адсорбции их коллоидными осадками гидрата аммония или сернокислого кальция. Этим способом можно очистить вирусы ящура и полиомиелита.